在上期中，我们共同探讨了同源重组法质粒构建的实验流程，那么在实验过程中需要特别注意哪些事项呢？接下来就让我们一起详细了解一下吧！

一、同源重组法质粒构建中的注意事项

(1) 引物设计：同源臂的长度应保持在15-20bp之间，GC含量宜控制在40%-60%。在计算引物Tm值时，仅需考虑特异性引物部分，而不包括同源臂和酶切位点。若引物长度超过40bp，建议采用PAGE纯化方式进行引物合成，以提升阳性克隆率。

(2) 模板选择：在PCR扩增插入片段时，若目标片段扩增困难，可先用不带同源臂的引物进行克隆，再以胶回收的产物为模板，用带有同源臂的引物进行二次PCR扩增，需注意此流程可能引入较多突变。

(3) 酶切与线性化：使用限制性内切酶进行载体线性化时务必确保完全切割，可以通过延长酶切时间或采用双酶切方法来实现。若使用单酶切线性化载体，需警惕原生环状质粒的残留，这可能导致转化结果不准确。

(4) 片段纯化：胶回收时应使用新的刀片，防止外源DNA污染。同时，确保胶回收产物的质量与浓度，以便后续进行准确计算。

(5) 比例与用量：按照载体与插入片段最优摩尔比1:2来严格计算两者的使用量，以提高重组效率。如果使用未经纯化的线性化克隆载体和插入片段的扩增产物，其加入总体积应不超过反应体系体积的1/5。

(6) 重组反应条件：重组反应需要在冰上配置反应体系，轻轻吸打混匀，避免剧烈振荡。反应的温度与时间要预设好，通常为37℃反应30分钟左右。无论反应时间过短还是过长都可能影响克隆效率。

(7) 转化过程：感受态细胞应在冰上解冻，加入重组产物时轻易混匀，避免对细胞造成损伤。热激的时间和温度要精确把握，热激后需迅速置于冰上降温。此外，转化产物的涂布量应适中，过多或过少均会影响阳性克隆的筛选。

(8) 鉴定环节：在进行菌落PCR鉴定时，要选择合适的引物和PCR程序，以确保鉴定结果的准确性。对于初步鉴定为阳性的菌落，建议进行测序确认，以最终确认重组质粒的完整性。

二、同源重组法质粒构建中的常见问题

1. 当胶回收产物浓度不足以进行连接时，可以增加实验的起始量。因为大多数胶回收试剂盒的回收率仅为30%-60%，在载体酶切和扩增片段时，跑胶体积可以设置为200μl。

2. 若扩增的PCR产物无条带或者条带较弱，应检查引物的Tm值和GC比率，必要时更换引物或调整PCR条件，以优化结果。

3. 在涂板后没有菌落或仅有极少菌落时，可能是线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不当或比例不佳，也可能是单酶切导致的载体自连，建议优先考虑使用双酶切法进行切割。

4. 发现菌液PCR无条带时，可能是由于载体连接失败或引物设计存在问题。

三、实验相关产品推荐

以下是相关实验产品推荐，旨在为您的实验提供帮助：

- 27106：质粒小提试剂盒，品牌：QIAprepSpinMiniprepKit（凯杰 Qiagen）

- D200596：孔酵母质粒小提试剂盒，品牌：Zymoprep-96 Yeast Plasmid Miniprep（Zymo Research）

- TD407：琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，品牌：简石生物

- UFC903096：Millipore超滤离心管—30kDa，品牌：密理博

- MDX006：高特异性高保真Pfu酶预混液，品牌：MeridianBiosciences

以上产品均可通过尊龙凯时获取，欢迎咨询有关产品及技术问题！

北京百奥创新科技有限公司专注于免疫学、细胞生物学、分子生物学等领域核心试剂产品的研发、生产与销售。作为中关村高新技术企业，我们依托中科院的科研力量，组建了由资深科学家和经验丰富的商业团队构成的研发团队，为全国超过10000家客户提供超过20000种优质产品。我们的目标是以高品质树立品牌，以优质服务赢得口碑，努力成为生物原料和生物化学试剂开发与成果转化的重要推动者，同时也是行业领先的优质供应商。